1，紫外和可見分光光度計(jì)能做什么？

• 測(cè)定溶液的濃度（含量）

此應(yīng)用，也叫“定量分析”，是zui常用的。

這是一種方法，通過(guò)與已知濃度的溶液比較，測(cè)定出未知濃度樣品的濃度。

• 測(cè)定材料的性質(zhì)

-例如，夏天在山中或海濱，冬天在滑雪場(chǎng)用的墨鏡、遮光劑化妝品和衣服。當(dāng)“透射比”被測(cè)量時(shí)，目標(biāo)波長(zhǎng)是否被真地切斷，是很明顯的。

-每種物質(zhì)都有其自己的特征“光譜”。通過(guò)與已知物質(zhì)的光譜比較，識(shí)別未知的樣品。（鑒定）

• 測(cè)定分子結(jié)構(gòu)

你知道一個(gè)物質(zhì)由分子組成，分子由一組原子組成嗎？每個(gè)分子有自己的特征光譜（位置，強(qiáng)度等） 。盡管困難，以其光譜為基礎(chǔ)的分子結(jié)構(gòu)測(cè)定被許多大學(xué)和公司實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

 2，比色分析

比色分析，又叫做吸光測(cè)定法，是根據(jù)物質(zhì)顏色來(lái)分析的一種方法。現(xiàn)在，讓我們看“顏色”是什么，“光”是什么，哪個(gè)顯示顏色。

2-1  光和色

2-1-1  光、無(wú)線電和 X射線（關(guān)于光）的關(guān)系

當(dāng)你被問光是什么的時(shí)候，你能立即做出回答嗎？包圍我們的“光” ，是一種電磁波，就像無(wú)線電和電視發(fā)出的無(wú)線電波，X光照片用的 X射線一樣。

 2-1-2  太陽(yáng)光與激光光束的比較  （白光和單色光）

在上頁(yè)表中顯示的光的形式中，200-400nm 波長(zhǎng)的光叫做紫外（UV） ，從400-800nm叫做可見（VIS），從 800nm到近 1 毫米是紅外（IR）。zui重要的是，僅可見光才能被我們的眼睛看見，并認(rèn)為是一個(gè)“顏色” ，就想它名字那樣。波長(zhǎng)決定了可見光的顏色：紅、藍(lán)等。

這就是彩虹中顏色的順序一直是相同的。

包含所有波長(zhǎng)的光，包括紫外，可見光和紅外，叫做“白光” （例如，太陽(yáng)光，白幟光等） 。另一方面，光的每種顏色（例如紅、藍(lán)等）叫做單色光。太陽(yáng)光發(fā)出的白光通過(guò)使用例如“濾光片”或“棱鏡”的工具可被分成 7 種類似彩虹的顏色（波長(zhǎng)） 。作為對(duì)比，激光光束發(fā)出的光僅包括一種波長(zhǎng)（也就是，一個(gè)單波長(zhǎng)）。

★ 白光：包含所有波長(zhǎng)的光；單色光：?jiǎn)尾ㄩL(zhǎng)的光

 2-1-3  蘋果為什么是紅的？  （關(guān)于顏色）

牛頓思考為什么蘋果從數(shù)上掉下。

這里，讓我們思考為什么蘋果看上去是紅色的。

晚上在漆黑的房間里，蘋果看上去是紅色的嗎？回答：不是。但是，同個(gè)蘋果在燈打開后或大白天顯紅色。這說(shuō)明我們需要光（這里，是白光）來(lái)看見“顏色” 。 

為什么蘋果看上去是紅色的，而不是藍(lán)色或黃色？

物質(zhì)，例如蘋果、汽車和衣服對(duì)顏色有偏好，就像我們一樣。

當(dāng)某種物質(zhì)暴露于包含各種顏色的光（白光）中時(shí)，它吸收，并僅從光中保持了它zui愛的顏色（一個(gè)現(xiàn)象叫“吸收”）。  它不喜歡的光（  叫做“補(bǔ)色”）被反射，這樣就形成了我們眼睛中看到的物質(zhì)的顏色。

換句話說(shuō)，蘋果喜歡藍(lán)色、綠色，不喜歡紅色。當(dāng)它暴露于白光中時(shí)，它會(huì)吸收藍(lán)色和綠色，看上去就像紅色，紅色就是補(bǔ)色。

記住：任何我們叫“顏色”的東西與“波長(zhǎng)”有關(guān)。

★ 物質(zhì)吸收特定波長(zhǎng)的光。我們看見的是補(bǔ)色。

 2-1-4  不可見光（紫外和紅外）

從目前的闡述看，你知道可見光是什么嗎？如果不知道，請(qǐng)溫習(xí)。

光的形式是什么？指像紅外和紫外那樣不可見的，而不是可見光。

• 紫外

紫外光能造成皮膚癌和曬黑。紫外光，簡(jiǎn)稱紫外，參見電磁波，波長(zhǎng)范圍從約400nm（上限）到約 100nm（下限） ，盡管定義不是那么嚴(yán)格（幾十 nm或以下的叫做軟 X-射線）。在光譜分析領(lǐng)域，200nm或以下的紫外區(qū)叫遠(yuǎn)紫外，300nm或以上的叫做近紫外。

通常，紫外和可見分光光度計(jì)能測(cè)量200nm開始的波長(zhǎng)。

• 紅外

我們經(jīng)常聽到這個(gè)詞， “紅外”在日常生活術(shù)語(yǔ)中經(jīng)常使用，例如遠(yuǎn)紅外烤架。紅外線指電磁波，波長(zhǎng)范圍從1毫米起（上限；注意：該范圍的一部分與微波的次毫米波重疊）到約 800nm（下限） 。由于紅外線有熱效應(yīng)，它也叫做熱射線。這就是為什么紅外線用于烤架的原因了。

盡管紅外線的分類有很多，通常波長(zhǎng) 2.5um 及以下叫做近紅外，2.5-25um 波長(zhǎng)叫紅外，大于 25um波長(zhǎng)的叫遠(yuǎn)紅外。 盡管紅外分光光度計(jì)用于紅外測(cè)量，一些紫外和可見分光光度計(jì)甚至可以測(cè)量近紅外區(qū)域的光。

 2-2 忽略清潔會(huì)增加吸光率（朗伯-比耳定律）

你喜歡熱帶魚嗎？盡管它們很可愛，但打掃魚缸是很麻煩的事，不是么？

A和B養(yǎng)魚。A很愛干凈，熱帶魚的魚缸總是很干凈、清晰。相反，B很懶惰，魚缸總是渾濁的。 他們的魚缸放在靠窗的地方。由于 A 的魚缸里的水很干凈，從窗口射進(jìn)來(lái)的大部分光可以通過(guò)魚缸看見。然而，B的魚缸的水很渾濁，很少有光透過(guò)魚缸。從窗口進(jìn)來(lái)的光透過(guò)魚缸的比率稱為“透射比”（T）。

“透射比” （%T）  通常以百分比形式表示。相反地，從窗口射進(jìn)來(lái)的光被魚缸里的水吸收的比率叫做“吸光率”（Abs）.

忽略清潔的魚缸里渾濁的水吸收更多的光來(lái)阻擋其路徑，增加吸光率，降低透射比。另一方面，魚缸里干凈的水能很好地傳輸光，其透射比接近 100%，吸光率幾乎為零。

我們用數(shù)學(xué)公式來(lái)解釋這個(gè)理論。透射比為I/I0，I0是從窗口進(jìn)入的光，I是穿過(guò)魚缸的光。另外，透射比為 10-ecL(公式 1)，L是魚缸的寬度（光學(xué)路徑長(zhǎng)度），c是缸內(nèi)水的渾濁度（濃度），e是常數(shù)（叫做“分子吸收常數(shù)” ） ，是物質(zhì)*的（在這個(gè)例子中，物質(zhì)產(chǎn)生了渾濁） 。由于吸光度是透射比倒數(shù)的對(duì)數(shù)，可由公式三表示，它與分子吸收系數(shù)，濃度和光學(xué)路徑長(zhǎng)度成正比。該公式稱為朗伯-比耳定律。

 2-3  顏色密度的測(cè)量（定量分析）

定量分析是一種分析方法，來(lái)測(cè)定某種物質(zhì)（溶液）的含量。比如，我們每天喝的水包含金屬，微量殘留農(nóng)藥，有機(jī)物等。但我們無(wú)法目測(cè)來(lái)測(cè)定其含量。

通常，在吸光測(cè)定法中，著色試劑被添加至標(biāo)本，由于與目標(biāo)物質(zhì)的反應(yīng)產(chǎn)生的顏色程度可被觀察到。事先準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)本（樣品） ，然后添加著色劑，使目標(biāo)物質(zhì)被染色。樣品的濃度是通過(guò)使用校正曲線，比較標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的吸光度來(lái)測(cè)定的。

讓我們看一下測(cè)量自來(lái)水中的鐵的步驟，作為例子。

2-3-1  樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液

為了測(cè)量物質(zhì)的濃度，通過(guò)將要測(cè)試的未知濃度標(biāo)本（樣品）與1 個(gè)已知濃度的標(biāo)本（標(biāo)準(zhǔn)溶液）的比較來(lái)測(cè)定其濃度。當(dāng)分析自來(lái)水中的鐵時(shí)，自來(lái)水是樣品，已知濃度的鐵溶液是標(biāo)準(zhǔn)溶液。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)溶液，要準(zhǔn)備一組不同鐵濃度的溶液。

如果樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液沒有在相同的條件下準(zhǔn)備和測(cè)量的話，無(wú)法獲得正確的結(jié)果。例如，樣品是自來(lái)水的話，標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)當(dāng)為水溶液，而不是酒精溶液。另外，如果樣品里添加了酸，它同樣應(yīng)當(dāng)添加至標(biāo)準(zhǔn)溶液中。

用于溶解物質(zhì)的液體，例如水或酒精被稱為“溶劑”，在該液體中溶解的物質(zhì)例如鐵，稱為“溶質(zhì)” 。如果溶劑和溶質(zhì)的吸收發(fā)生在相同的波長(zhǎng)，那就無(wú)法獲得正確的結(jié)果。

由于水在可見和紫外區(qū)域沒有吸收，所以它通常被使用。盡管有機(jī)溶劑也經(jīng)常使用，由于大部分在紫外區(qū)（不是可見區(qū)）有吸收，因此使用它們的時(shí)候要小心。 

 2-3-2 魔幻成分（著色劑）

你在觀察自來(lái)水的時(shí)候，能看見鐵的顏色嗎？  比色分析是分析顏色的一種方法。如果顏色不可見（在可見區(qū)域） ，那么分析是無(wú)法進(jìn)行的。所以，我們要做什么呢？必要的僅僅是用魔幻成分給鐵染色。給溶液中目標(biāo)物質(zhì)染色的成分叫“著色劑”或“顏色試劑”。

自來(lái)水包含的鐵越多，顏色就越深（高吸光度） 。相反，自來(lái)水中的鐵越少，顏色越淺（低吸光度） 。由于每種成分都準(zhǔn)備了不同的著色劑，應(yīng)當(dāng)根據(jù)分析成分正確使用。

2-3-3  校正曲線

溶液已經(jīng)配好，現(xiàn)在測(cè)量程序要開始了。要測(cè)量的波長(zhǎng)必須決定好。

由于這個(gè)問題在后面章節(jié)光譜中被解釋，讓我們繼續(xù)。下一步是測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度來(lái)獲得校正曲線。這里，水平軸是濃度，縱軸是吸光度。為了獲得該曲線，從低的鐵濃度向高的鐵濃度的順序測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)溶液。獲得的濃度和吸光度的值進(jìn)行繪圖，形成下面圖表。

這稱為“校正曲線” 。盡管通常是線性的，如果濃度過(guò)低或過(guò)高，有可能是二次曲線（曲線向上或向下）。

在通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)量而獲得校正曲線以后，測(cè)量樣品。在樣品的吸光度測(cè)量后，通過(guò)與校正曲線的比較，可以測(cè)定其濃度。請(qǐng)見校正曲線圖。從縱軸上的測(cè)量吸光度出發(fā)，在校正曲線上畫出一條水平線，從該水平線的截距上畫一條垂直線。該線上列出的值就是濃度。在定量分析中，樣品的濃度是以這樣的方式?jīng)Q定的。 

2-4  觀察顏色（光譜）

2-4-1  光譜是什么？

在定量分析中，通過(guò)比較物質(zhì)吸收某波長(zhǎng)光的多少來(lái)測(cè)定濃度的。在其他波長(zhǎng)，它吸收多少？“光譜”顯示物質(zhì)在每個(gè)波長(zhǎng)吸收的多少。

在紫外可見分光光度計(jì)中，可以測(cè)量發(fā)射光譜和吸收光譜。

光譜上的點(diǎn)，橫坐標(biāo)是波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)是透射比或吸光度。請(qǐng)?jiān)俅斡涀。涸诳聪旅姘l(fā)射和吸收光譜圖的時(shí)候，注意發(fā)射和吸收的關(guān)系。

2-4-2  從光譜中能知道什么？

盡管鐵的定量分析在前面的部分執(zhí)行，哪個(gè)波長(zhǎng)（nm）應(yīng)當(dāng)被真實(shí)地測(cè)量？ 由于有較大吸收的波長(zhǎng)的靈敏度更高，我們希望選擇盡可能有zui大吸收的波長(zhǎng)。  這與吸收譜圖有關(guān)。請(qǐng)看下面的譜圖，是添加了著色劑的鐵溶液。該譜圖表明在510nm 附近的吸收是zui大的（zui大吸收處的波長(zhǎng)稱為zui大吸收波長(zhǎng)） 。就表明鐵濃度應(yīng)當(dāng)在510nm附近測(cè)量。

光譜的形狀與添加了著色劑的鐵溶液有特別關(guān)系（凈吸收亮度隨濃度變化）。 如果未知溶液的測(cè)量圖譜與圖中的光譜一致，就說(shuō)明樣品是加了著色劑的鐵溶液。物質(zhì)的特性通過(guò)測(cè)量其光譜來(lái)檢驗(yàn)。

3  分光光度計(jì)的機(jī)理

3-1  人和機(jī)器的差異（普通機(jī)理）

你如何知道一個(gè)顏色有多厚多薄。就我們知道的，在紫外和可見波長(zhǎng)范圍（200-800nm）中物質(zhì)能很好地吸收什么顏色（波長(zhǎng)）？

盡管人類能通過(guò)感知物質(zhì)的顏色或識(shí)別顏色的陰影預(yù)測(cè)總的吸收波長(zhǎng)，但無(wú)法獲得的波長(zhǎng)估計(jì)，而且還有個(gè)體差異。另外，人眼無(wú)法看見紫外區(qū)。

由于這個(gè)原因， “紫外可見分光光度計(jì)”系統(tǒng)，沒有個(gè)體差異，能夠測(cè)量紫外區(qū)。 

在分光光度計(jì)中，通過(guò)使用人造光源替代陽(yáng)光，檢測(cè)器和表替代人眼來(lái)測(cè)量顏色（波長(zhǎng)） 。與人如何看見物質(zhì)zui大的區(qū)別就是：在分光光度計(jì)中，白光不是直接照射到物體，而是利用棱鏡或衍射光柵將光分成許多顏色，然后每種顏色（單色光）射到物體上（掃描）來(lái)測(cè)量該顏色的特定波長(zhǎng)。

*在分光光度計(jì)中，白光分成單色光來(lái)測(cè)量吸收。

3-2  光學(xué)系統(tǒng)

3-2-1  有沒有僅用于樣品的位置？  （單光束和雙光束）

• 單光束系統(tǒng)

在吸收測(cè)量中，每次樣品和參比都進(jìn)行測(cè)量和比較。

由于在單光束系統(tǒng)中只有 1 個(gè)位子用于測(cè)量， 樣品和參比必須被交換，一個(gè) 100%調(diào)節(jié)（或0Abs調(diào)節(jié)）必須被進(jìn)行，當(dāng)測(cè)量波長(zhǎng)變化時(shí)。

盡管系統(tǒng)主要用于定量測(cè)量，小的不貴的系統(tǒng)配置是可以實(shí)現(xiàn)的，光源波動(dòng)（漂移）不能被補(bǔ)償。

• 雙光束系統(tǒng)

單光束系統(tǒng)只有一個(gè)測(cè)量位置，雙光束系統(tǒng)包含的樣品位置和參比位置。由于不需要更換樣品和參比（不需要每次測(cè)量波長(zhǎng)的變化后，100%或 0Abs 的調(diào)節(jié)），所以它適合定性和定量分析。

3-2-2  小心選擇波長(zhǎng)（單個(gè)單色和雙單色）

掌管場(chǎng)所的人員負(fù)責(zé)嚴(yán)格檢查入口的來(lái)客，比如“學(xué)生禁止進(jìn)入” 。然而，有沒有學(xué)生偷偷進(jìn)入大廳呢？甚至檢查員很好地檢查了每個(gè)懷疑的進(jìn)入者，但還是經(jīng)常會(huì)聽到這種情況下有人未經(jīng)檢查就進(jìn)入了。

單色（單色器或分光鏡）是一種機(jī)器，將需要的波長(zhǎng)光從含有多波長(zhǎng)的光中取出，扮演著在入口檢查光的角色，可以這么說(shuō)。但是，波長(zhǎng)，不是要求的波長(zhǎng)，會(huì)混入，盡管有檢查（這個(gè)混入或損失的光被稱為雜散光） 。在進(jìn)行嚴(yán)格測(cè)試時(shí)，該雜散光可能會(huì)起到壞影響。所以，在雙單色系統(tǒng)中，通過(guò)檢查的光被再次檢查。

在單個(gè)單色系統(tǒng)中，只檢查一次。 

3-3  分光光度計(jì)的部件

3-3-1  光源

兩種類型的燈用于分光光度計(jì)光源：1 個(gè)氫放電管用于測(cè)量紫外區(qū)，1 個(gè)鎢燈測(cè)量可見/近紅外區(qū)域。

3-3-2  分光鏡

分光鏡從光源（白光）中選擇單色光（也就是1 個(gè)波長(zhǎng)）。

有 3 種分光鏡：A  過(guò)濾型 B棱鏡類型 C  光柵（衍射光柵）類型

3-3-3  樣品池

放樣品的容器通常叫做“池”，由玻璃或石英做成。玻璃池用來(lái)測(cè)量340nm以上的可見范圍，因?yàn)樗谧贤鈪^(qū)波長(zhǎng) 340nm或以下幾乎不發(fā)射任何光。另一方面，石英池會(huì)發(fā)射所有波長(zhǎng)的光，從整個(gè)紫外到可見區(qū)域。然而，由于石英池很貴，他們主要用于測(cè)量紫外區(qū)。

3-3-4  檢測(cè)器

檢測(cè)器的作用就是將樣品的發(fā)射光轉(zhuǎn)化成電信號(hào)。

有多種類型的檢測(cè)器，包括 A光電池 B  光電倍增管等